Procédure pour le séquençage

  1. Préparer ses échantillons
  2. Remplir le formulaire en ligne
  3. Imprimer une copie du PDF de la requête et la laisser avec les tubes à la plateforme génomique

Les échantillons et les amorces doivent être mis dans des tubes de 1.5mL clairement identifiés.:

  • Un tube avec l’ADN (2µL/reaction)
  • Un tube avec l’amorce (2µL/reaction, à 5µM).

Si un échantillon/amorce doit être utilisé plus qu’une fois, augmenter le volume dans le même tube.

Resuspendre l'ADN dans l'eau. Ne pas utiliser de TE, car l'EDTA peut inhiber la réaction de séquençage.

Vérifier la concentration de votre ADN plasmidique avec un spectro. Pour les produits PCR, faire migrer sur un gel d'agarose (après la purification) et comparer avec un marqueur de poids moléculaire de concentration connue.

Concentration et quantités requises

ADN Concentration Quantité
Produit PCR
100 - 200 pb
200 - 500 bp
500 - 2000 pb
2000 pb et plus

1 ng/µl
5 ng/µl
10 ng/µl
25 ng/µl

2 µl/réaction
minimum 5 µl
Plasmide 200 à 300 ng/µl 2 µl/réaction
minimum 5 µl
BAC 1 µg/µl 5 µl/réaction

Amorces

Les amorces suivantes sont fournies gratuitement par la plateforme :

M13+       5'- TGT AAA ACG ACG GCC AGT -3'
M13-5'- TCA CAC AGG AAA CAG CTA TGA C -3'
SP65'- GAT TTA GGT GAC ACT ATA G -3'
T35'- ATT AAC CCT CAC TAA AGG GA -3'
T7+5'- TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG -3'
T7-5'- GCT AGT TAT TGC TCA GCG G -3'

Design d'amorces (logiciels gratuits disponibles : Primer 3, PrimerQuest)

  • Longueur des amorces entre 18 et 24 nucléotides.
  • Pourcentage de GC entre 40% et 60%.
  • Tm entre 50°C et 60°C.
  • Éviter les chaînes de nucléotides répétés (ex : AAAAA ou GGGGGG).

Où apporter/envoyer les tubes

Plateforme génomique, IRIC
Université de Montréal
Pavillon Marcelle-Coutu, labo 4462
2950, Chemin de Polytechnique
Montréal, H3T 1J4

Si vous venez en personne,
SVP déposez les échantillons sur la table « Échantillons pour les plateformes »,
située dans l’entrée du 2950 chemin de Polytechnique.


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Adresse pour les services de messagerie:
Raphaëlle Lambert
Plateforme génomique, IRIC
Université de Montréal
Pavillon Marcelle-Coutu
2950, Chemin de Polytechnique
Montréal, H3T 1J4

La plateforme est ouverte du lundi au vendredi entre 9h00 et 17h00.

Déroulement

  1. Réaction de séquençage avec le BigDye® Terminator v3.1 (Applied Biosystems).
     25 cycles 
     curly brace 
    96°C 96°C 50°C 60°C 4°C
    4 min15 sec5 sec4 min
  2. Purification par précipitation à l'éthanol.
  3. Migration par électrophorèse en capillaire en utilisant un séquenceur automatique ABI 3730 à 48 capillaires

Récupération des résultats

Chaque usager a un accès personnel à ses séquences sur un serveur sécurisé.

Dans la section «Section Sécurisée », entrez votre courriel et mot de passe. Vous pouvez alors récupérer vos séquences en format texte (fichier .txt) et en format chromatogramme (fichier .ab1). Nous vous recommandons fortement de visualiser vos chromatogrammes pour détecter des problèmes avec la séquence invisibles dans le fichier texte (seconde séquence, contamination, séquence de mauvaise qualité, etc.).

Nous ne garantissons pas les résultats de séquençage car ils sont le reflet de la qualité de vos échantillons. Une réaction qui fonctionne bien donne un maximum de 900 à 1000 pb.

Nous conservons vos échantillons pour un maximum de 2 semaines

Si vous avez des questions, contactez-nous à l'aide de notre formulaire de contact